沼氣池厭氧消化污泥體系的研究
摘自《中國(guó)沼氣》第6期 趙宇莎 鄭丹 于琪 茍敬 湯岳琴
沼氣工程沼氣池厭氧消化能有效地促進(jìn)能源與環(huán)境的協(xié)調(diào)發(fā) 展,一直備受關(guān)注。該過(guò)程通常需要不同微生物群 落(發(fā)酵細(xì)*,產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌和產(chǎn)甲烷菌)的參與協(xié) 作,才能實(shí)現(xiàn)甲烷的生產(chǎn)。研究證實(shí),有更多功 能與特性未知的未培養(yǎng)微生物參與了沼氣工程沼氣池厭氧消化過(guò) 程,產(chǎn)甲烷機(jī)制比預(yù)期的更加復(fù)雜2。因此,鑒定 沼氣工程沼氣池厭氧消化體系中的微生物多樣性,有助于深入理解 產(chǎn)甲烷機(jī)制并指導(dǎo)工藝優(yōu)化調(diào)控。宏基因組學(xué)是近 20年新興的科學(xué)領(lǐng)域,它避開微生物的分離培養(yǎng)過(guò)
程,直接從基因?qū)用嬖谎芯课⑸锏亩鄻有?可*大限度地識(shí)別環(huán)境微生物的群落信息。基于宏基因組的分子生物學(xué)技術(shù)(如DGGE,16sRNA基因克隆文庫(kù),T-RFLP等)的發(fā)展,已經(jīng)成為分析沼氣工程沼氣池厭氧消化過(guò)程優(yōu)勢(shì)微生物的重要平臺(tái)。但這些傳統(tǒng)方法鑒定到的優(yōu)勢(shì)菌群往往并非是“真正”的功能微生物。
DNA穩(wěn)定同位素探針( DNA stable- Isotope pro-bing,DNA-SP)是一種新興的分子生態(tài)學(xué)技術(shù),可
用于甄別復(fù)雜環(huán)境中參與特殊代謝功能的微生物。 其基本原理為:環(huán)境樣品經(jīng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記的底物 (以C為主)培養(yǎng)后,微生物利用“C底物生長(zhǎng)繁殖 合成"CDNA,通過(guò)浮力密度差異將”CDNA與”C DNA分離,進(jìn)一步對(duì)CDNA進(jìn)行分析即可獲得功 能微生物的信息。由于 DNA-SIP僅以來(lái)源于底物 利用菌的CDNA為研究對(duì)象,因此極大地降低了 環(huán)境微生物群落的復(fù)雜性,從而將底物代謝過(guò)程與 微生物群落組成直接相聯(lián)系3。鑒于 DNA-SIH技 術(shù)的優(yōu)勢(shì),現(xiàn)已被應(yīng)用于不同環(huán)境中各類微生物功 能菌的鑒定(如甲基互營(yíng),生物降解,碳氮循環(huán)等過(guò) 程),但其在沼氣工程沼氣池厭氧消化過(guò)程中的應(yīng)用相對(duì)較少6 此外, DNA-SIP存在CDNA回收量小、時(shí)間
長(zhǎng)、容易交叉標(biāo)記等缺陷,因此,探索合適的標(biāo)記及 離心條件并獲得足夠的CDNA是成功富集功能微
生物的關(guān)鍵。本研究以”C葡萄糖為底物,考察
了不同條件對(duì)沼氣工程沼氣池厭氧消化污泥中葡萄糖利用菌的標(biāo)記 效果旨在為鑒定真正的沼氣工程沼氣池厭氧消化功能群提供基礎(chǔ),
進(jìn)而促進(jìn)對(duì)沼氣工程沼氣池厭氧產(chǎn)甲烷機(jī)制的理解。
材料與方法
1.I污泥來(lái)源
用于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的污泥來(lái)自本實(shí)驗(yàn)的纖維
素沼氣工程沼氣池厭氧消化反應(yīng)器。該完全混合型反應(yīng)器總體積3L
工作體積2L,纖維素進(jìn)料負(fù)荷為1gLd-1,在53℃
低速攪拌(85mm)條件下連續(xù)穩(wěn)定運(yùn)行212d。
1.2試劑
主要試劑如”C葡萄糖(C,99%),CsCl,CTAB購(gòu)于 sIgma公司(美國(guó))
1.3污泥樣品的標(biāo)記及分析
1.3.1標(biāo)記樣品的培養(yǎng)及采樣
取30mL沼氣工程沼氣池厭氧消化污泥于50mL沼氣工程沼氣池厭氧瓶中,通
氮?dú)庵脫Q空氣后,立即采用丁基膠塞和鋁蓋密封并放置于搖床中餓養(yǎng)*污泥停止產(chǎn)氣。隨后將葡萄糖溶于滅菌水后采用無(wú)菌注射器投入沼氣工程沼氣池厭氧瓶,同時(shí)補(bǔ)充少量微量元素溶液,于53℃和150mpm條件下培養(yǎng)并取樣分析。底物添加及取樣操作均在沼氣工程沼氣池厭氧手套箱( Gene Science AG30,美國(guó))中進(jìn)行。所有處理均設(shè)置兩個(gè)平行樣,并分別以C葡萄糖作為對(duì)照。其中,使用的微量元素溶液組分如下(gL)FeCl3·6H2O,1.35;MnCl2·4H2O,0.1;CaC2·2H,0,0.1;ZnC2,0.1;CuO2H20,0.025;H3BO3,0 01;Na2MO4·2H20,0.024;NaCl,1.O;Na2SeO3·5
H2O,0.026;次氮基三乙酸(NTA),12.8 1.3.2標(biāo)記過(guò)程的氣體和樣品收集
定期采用10mL無(wú)菌注射器測(cè)定產(chǎn)氣量 品樣定期取樣后,于12000pm,4℃離心10min后
污泥沉淀和適量體積PBS緩沖溶液混合震蕩,于
12000m,4℃離心10min,反復(fù)清洗2-3次后,去除上清液,污泥沉淀保存于-80℃,用于后續(xù)的PCR1.3.3超高速密度梯度離心分離
利用常規(guī)CTAB法提取污泥的總DNA。取
Hg DNA,與4.8 mL CsCl溶液,1.2 mL Grader
er(GB緩沖液)混勻,采用10m無(wú)菌注射器將混合液移*6ml超高速離心管中,于超高速離心機(jī)( Beckman Coulter, OptimaI.80XP,美國(guó))離心形成浮力密度梯度區(qū)帶。離心后使用軟管連接精密注射泵( Harvard Apparatus Pump Il Pico Plus,美國(guó))與離心管,利用無(wú)菌水的水壓收集各層樣品,并采用折光儀( Reichert AR200,美國(guó))測(cè)定各層級(jí)折光率。折光率與密度的換算公式如下:
n=0.07969+1.2649
式中:n為液體折光率;p為液體密度,gmL
1.3.4熒光定量PCR分析
對(duì)各層樣品的16 SrNA基因含量(拷貝數(shù))進(jìn)行熒光定量PCR分析。反應(yīng)體系總體積為20μl包括:10uM引物Eu518F及Eu27F各0.8ul,SYBR染液10山1,DNA2.0,滅菌水6.4ul。PCR反應(yīng) 條件如下:95℃,預(yù)變性308;95℃,變性10s,50℃退火5s,72℃,延伸40s,共40個(gè)循環(huán);融解95℃10s,65℃60s,97℃1s;冷卻37℃30s。以16sTDNA基因的豐度(每層拷貝數(shù)與各層級(jí)拷貝數(shù)總和的比值)為縱坐標(biāo),浮力密度為橫坐標(biāo),可得16mDNA基因在不同浮力密度中的分布規(guī)律圖。
1.4DNA-SP標(biāo)記條件的優(yōu)化
1.4.1離心轉(zhuǎn)速對(duì)DNA-SIP標(biāo)記效果的影響
取底物投加量為30mg葡萄糖,標(biāo)記時(shí)間為4天的樣品,分別在45400mpm和50300mm的轉(zhuǎn)速下于20℃離心40h,考察超高速離心轉(zhuǎn)速對(duì)標(biāo)記效果的影響
1.4.2底物投加量對(duì) DNA-SIP標(biāo)記效果的影響
分別投加總量為30mg和60mg的葡萄糖,考察底物投機(jī)量對(duì)標(biāo)記效果的影響。30mg葡萄糖次性投加,停止產(chǎn)氣時(shí)(4d)取樣。60mg葡萄糖于 第0和6天分別投加30mg,取樣時(shí)間為第11天
143若平消它每DP標(biāo)定效果的響
10mn。利用上清液稀釋使得污泥固含量分別為 a1%,0.2%,0.4%,2.1%(w/w)。分批投加總量 為100mg的葡萄糖進(jìn)行標(biāo)記培養(yǎng),即于第0,4和8 天分別投加333mg,取樣時(shí)間為第8和12天(取 樣時(shí)底物投加總量分別為660m和100mg)。樣 品經(jīng)20℃,45400m,40h超離速離心分層后,考察 污泥固含量對(duì)標(biāo)記效果的影響。
結(jié)果
離心條件優(yōu)化
實(shí)驗(yàn)室前期小試發(fā)現(xiàn):經(jīng)C葡萄糖標(biāo)記的污泥中的CDNA與CDNA的浮力密度分別為1.70
及1.72-1.74gmL左右(數(shù)據(jù)未顯示)。因此,本研究考察了文獻(xiàn)報(bào)道常用的兩個(gè)離心轉(zhuǎn)速(50300mm和45400mpm)對(duì)污泥樣品的 DNA-SIP 標(biāo)記效果。表1顯示:不同轉(zhuǎn)速下形成的CC介質(zhì) 中相鄰梯度區(qū)帶的浮力密度差有較大差異。由表1 可知轉(zhuǎn)速為45400mpm形成的浮力密度差較小。為 確保兩種DNA離心后相隔一個(gè)區(qū)帶,能被有效分 離,故后續(xù)離心條件設(shè)為20℃,45400mpm,40h 表1不同轉(zhuǎn)速條件下微生物DNA的分離效果(gmL
2.2底物投加量?jī)?yōu)化
分別向污泥中投加總量為30mg和60mg的葡萄糖,產(chǎn)氣量如圖1所示。由圖可知:所有樣品的產(chǎn)氣量均在第1天迅速升高,微生物每消耗完30mg葡萄糖大約需4~6d,隨后逐漸停止產(chǎn)氣。且C
葡萄糖與C葡萄糖的產(chǎn)氣趨勢(shì)及產(chǎn)氣量基本吻合,可作為對(duì)照進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí),根據(jù)產(chǎn)氣結(jié)果,將30mg和60mg葡萄糖標(biāo)記樣品的取樣時(shí)間分別設(shè)置為第4天和第11天。
標(biāo)記后的污泥樣品經(jīng)超高速離心分層以后,利 用定量PCR檢測(cè)每層的16 S rDNA基因含量。獲得 16 S rDNA基因豐度在不同浮力密度中的分布規(guī)律, 如圖3和圖4所示。由圖可知,在輕密度層1.69~ 1.71gmL的范圍內(nèi),所有樣品均出現(xiàn)*高豐度, 這表明污泥樣品CDNA在1.70gm-左右的密度 層被富集。在重密度層1.72~1.74gmL的范圍 內(nèi),投加有30mgC-葡萄糖的污泥樣品僅檢測(cè)到 較低的16 S rdNA基因拷貝數(shù),表明該條件下C DNA富集程度不高。投加有60mg"C-葡萄糖的樣 品CDNA豐度明顯提高,兩個(gè)平行樣品的豐度分 別達(dá)到了10.41%和6.05%,而C葡萄糖對(duì)照樣品 中的豐度僅為1.0%,這表明60mg的C-葡萄糖可 以富集到更多的CDNA,功能菌能被有效標(biāo)記。 但圖3和圖4也顯示,在1.72~1.74g·mL前后的 密度層中也能檢測(cè)到一定數(shù)量的CDNA。因此,為了 為提高重密度層中CDNA的豐度,減少非目標(biāo)微生
2.3污泥固含量?jī)?yōu)化
污泥固含量對(duì) DNA-SIP標(biāo)記效果的影響如圖5~ 圖8所示。由圖可知:在1.72-1.74gmL的密度范 圍內(nèi),污泥固含量為0.1%,0.2%和0.4%(w/w)的所 有樣品的CDNA拷貝數(shù)明顯高于2.1%的樣品。 當(dāng)?shù)孜锿都恿繛?6.6mg時(shí)(標(biāo)記8天的樣 品),C-DNA主要存在于1.72gmL左右的密度層,且不同污泥固含量樣品的"CDNA豐度差異較大。污泥固含量為0.1%,0.2%,0.4%和2.1%(w/w)的樣品中,C-DNA豐度分別約為16.3%10%,10%和8.2%。這表示在該底物濃度下污泥固含量越低,C-DNA富集程度越高。而在更“重”的密度層1.74g·mL附近,各污泥固含量的CDNA豐度均低于5%。
當(dāng)?shù)孜锿都恿繛?00mg時(shí)(標(biāo)記12d的樣品),與第8天的標(biāo)記樣品相比,所有污泥樣品在72-1.74g·mL密度層的CDNA豐度均有明顯提升。尤其在1.74g·mL的密度層,除污泥固含量為2.1%的樣品外,其它樣品的CDNA豐度均從第8天的低于5%提升*15%左右。上述結(jié)果
表明:當(dāng)?shù)孜锿都恿繌?6.6mg增*100mg時(shí),可 有效提高CDNA在重密度層的豐度,顯示出更好 的標(biāo)記效果。此外2.1%固含量的污泥樣品中的CDNA拷貝數(shù)在1.72-1.74gmL密度層仍然*低,表明即使投加更高濃度的底物,相對(duì)較低的污泥固含量仍更有利于CDNA的富集。但在污泥固含量為0.4%,0.2%,0.1%的樣品中,CDNA在1.74gmL密度層的豐度并未隨著污泥固含量的減少而增大(分別為16.3%,14.2%和14%)。這可能是底物投加量已超過(guò)污泥中微生物的代謝水
平,大部分功能微生物已被標(biāo)記,若繼續(xù)增加底物投 加量難以提高樣品的標(biāo)記效果。
討論
DNA-SIH具有鑒定不同環(huán)境中“真正”功能微 物的優(yōu)勢(shì)。合適的標(biāo)記及離心條件可以避免底物 二級(jí)利用,確保DNA的標(biāo)記及富集效果,是決定 該技術(shù)成功的關(guān)鍵。但標(biāo)記效果受到多因素的影 響:如環(huán)境樣品性質(zhì)、微生物種類、底物結(jié)構(gòu)、標(biāo)記時(shí) 間離心轉(zhuǎn)速及時(shí)間等, DNA-SIP的培養(yǎng)條件及離心 條件難以標(biāo)準(zhǔn)化。鑒于利用 DNA-SIP識(shí)別沼氣工程沼氣池厭氧 消化功能微生物的研究相對(duì)較少,本研究考察了不 同條件(離心轉(zhuǎn)速、底物投加量和污泥固含量)對(duì)厭 氧污泥中葡萄糖利用菌的標(biāo)記效果的影響。 利用超高速密度梯度離心技術(shù)可有效地將環(huán)境 總DNA中的CDNA與CDNA有效分離。本研 究發(fā)現(xiàn)45400mm的轉(zhuǎn)速比50300mpm有更好的CDNA富集效果。據(jù)報(bào)道,DNA在CaC1介質(zhì)中的浮力密度與微生物的GC含量成正比”。但無(wú)論哪種轉(zhuǎn)速條件,重浮力密度層仍然同時(shí)含有2CDNA與CDNA。 Lueders8等發(fā)現(xiàn),即使采用純菌的CDNA進(jìn)行超高速離心,重密度層中仍能檢測(cè)到0.7%的CDNA。因此,這說(shuō)明目標(biāo)微生物很難00%被標(biāo)記, DNA-SIF實(shí)驗(yàn)必須設(shè)計(jì)C底物的對(duì)照樣品。
研究表明,當(dāng) C-DNA豐度接近20%時(shí),更容 易從環(huán)境樣品總DNA中分離出"CDNA。而C DNA的生成伴隨著微生物細(xì)胞對(duì)底物的同化利用, 這表明CDNA豐度與底物投加量和微生物種群數(shù) 量(本文為污泥固含量)存在直接聯(lián)系。底物投加 量?jī)?yōu)化結(jié)果顯示:在1.2-1.74g·mL-的密度范
圍內(nèi),投加30mg1C-葡萄糖的污泥樣品的C.DNA
豐度較低。目前尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)確定底物投加量
但底物濃度過(guò)低難以標(biāo)記到目標(biāo)微生物,因?yàn)閮H有
1/3的底物被微生物用于合成自身物質(zhì)。此外,加入體系的底物被微生物同化之前會(huì)有一個(gè)稀釋過(guò)
程,這使得微生物會(huì)暫時(shí)利用其他碳源或中間代謝產(chǎn)物,這一特性降低了C-DNA的比例,進(jìn)一步增加了計(jì)算底物投加量的難度°。雖然分批投加60mgC-葡萄糖可以將C-DNA豐度提高到10.41%,但仍含有較多的非目標(biāo)微生物。因此,在后續(xù)考察污泥固含量的研究中,將"C-葡萄糖投加量提高到了100mg,此時(shí)污泥中C-DNA豐度*高可達(dá)16.3%。上述結(jié)果表明,高的底物投加量有助于提高CDNA豐度。但底物投加量過(guò)高,一方面會(huì)增加DNA-SIP的成本;另一方面會(huì)使樣品脫離原始狀態(tài)群落代謝過(guò)程受到影響,產(chǎn)生微生物富集偏差,不符合 DNA-SIP原位鑒定的宗旨。因此,在滿足CDNA的標(biāo)記效果及分離效果的基礎(chǔ)上,采用*少的C底物是理想的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。污泥固含量研究結(jié)果顯示:當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí)(不高于污泥*高代謝水平),污泥固含量越低,C-DNA富集程度越高。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)底物量與微生物種群數(shù)量需要有合適的比例,才能獲得*高的標(biāo)記CDNA。不同研究報(bào)道中的微生物菌群生態(tài)位、生理代謝差異極大,因此,非常有必要對(duì)這兩個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化
4結(jié)論
選擇合適的標(biāo)記及離心條件以獲得足夠的C DNA,是利用 DNA-SIR技術(shù)成功富集功能微生物的關(guān)鍵。本研究以C葡萄糖為底物,選取離心轉(zhuǎn)速,底物投加量和污泥固含量3個(gè)重要因素,考察了它 們對(duì)沼氣工程沼氣池厭氧消化污泥中葡萄糖利用菌的 DNA-SIP標(biāo)記效果的影響。結(jié)果顯示,相對(duì)低的轉(zhuǎn)速、高底物投 加量及低污泥固含量可以獲得較高的CDNA豐 度。但底物量不能一味增加,需同時(shí)考慮微生物的 代謝水平、與環(huán)境條件的一致性等因素,在盡量減少